建立PCR反應體系時(shí)需注意的幾個(gè)問(wèn)題
點(diǎn)擊次數：1793 更新時(shí)間：2020-11-09
PCR鏈式反應，也稱(chēng)聚合酶鏈式反應，是一種體外酶促合成特定DNA片段的方法。它由幾個(gè)反應組成，如高溫變性、低溫退火和在合適溫度下延伸，這些反應在循環(huán)，進(jìn)行，以便能夠快速擴增目標DNA。它具有特異性強、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)的特點(diǎn)。
建立PCR反應體系時(shí)需注意的幾個(gè)問(wèn)題
首先要說(shuō)的是Taq酶，其特征是5`→3`DNA聚合酶活性，缺乏5`→3`核酸外切酶活性，在70-75攝氏度時(shí)活性較高。在典型的聚合酶鏈反應中，當總反應體積為100微升時(shí)，需要約2.5微升Taq酶。需要注意的是，使用的酶量太高，不會(huì )引起非特異性擴增，而當酶量太低時(shí)，合成產(chǎn)物的量會(huì )減少。
第二要注意的是dNTP的質(zhì)量和濃度。脫氧核糖核酸的質(zhì)量和濃度與聚合酶鏈反應擴增效率密切相關(guān)。在PCR反應中，dNTP一般應為50 ~ 200 umol/L，濃度過(guò)低會(huì )降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，dNTP可以與Mg2結合降低游離Mg2的濃度。四種dNTP的濃度應該相等(如摩爾制劑)，如果其中任何一種不同于其他種類(lèi)(高或低)，就會(huì )造成不匹配；dNTP保存不當，使其不穩定，不活躍。少量包裝，在-20攝氏度冷凍。反復凍融會(huì )降解dNTPdNTP溶液呈酸性，應配制成高濃度，然后用1M NaOH或1M Tris-HCl緩沖液調節pH值至7.0 ~ 7.5。
第三、模板的數量。在一般的聚合酶鏈反應擴增中，104到107個(gè)模板分子可以獲得滿(mǎn)意的結果。
第四、Mg2濃度，一般PCR反應中，當各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2
濃度一般為1.5 ~ 2.0 mmol/L，Mg2濃度過(guò)高，反應特異性降低，出現非特異性擴增。濃度過(guò)低，Taq DNA聚合酶活性降低，反應產(chǎn)物減少。
后，引物是聚合酶鏈反應特異性反應的關(guān)鍵，聚合酶鏈反應產(chǎn)物的特異性取決于導入
DNA與模板的互補程度。為了保持尹武，的完整性，應避免反復凍融。
當然要特別注意加入的水，一個(gè)是ph，一個(gè)是純度。
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