PCR反應體系構建中引物的設計原則
點(diǎn)擊次數：992 更新時(shí)間：2020-11-16
引物是PCR反應體系構建的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上任何一段模板DWA序列,就能按其設計互補的寡桉苷酸鏈做引物,利用PR就可將模板DWA在體外擴增。
PCR反應體系構建中引物的設計原則：
1、引物長(cháng)度:15-30bp ，常用為20bp左右；
2、引物擴增跨度:以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段；
3、避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補，不然會(huì )形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條??；
4、引物堿基:G+C含量以40-60M為宜，G+C 太少擴增效果不佳，G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGc一般隨機分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或咤啶核苷酸的成串排列；
5、引物3端的堿基,特別是末及倒數第二個(gè)堿基,應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失??；
6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴增的靶序列一般有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很友好；
7、引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量以每條引物0.1-1umol或10-100pmo1,以較低引物量產(chǎn)生所需要的結果為準，引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。
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